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季 平 卢思广 陈 军 2005-12-13 12:59:46 中华医学实践杂志 2004年2月第3卷第2期

【摘要】 目的 系统地研究HSP患儿T淋巴细胞的免疫功能及地塞米松的作用机制。方法 HSP患儿健康儿童的外周血单个核细胞（PBMC）（分地塞米松组空白对照组）体外培养后以流式细胞仪检测T淋巴细胞活化抗原CD ₃ CD ₂₅ 及T淋巴细胞的凋亡百分比，以ELISA法检测白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）的水平。结果 HSP患儿与健康儿童比较，PBMC的CD ₃ CD ₂₅ 抗原表达量明显升高（P=0.011），IL-2水平明显降低（P=0.0056），IL-4水平明显升高（P=0.00023），凋亡百分比明显降低（P=0.003）;HSP患儿地塞米松组与空白对照组比较，CD ₃ CD ₂₅ 抗原表达量明显降低（P=0.024），IL-2水平稍有下降但差异无显著性（P=0.569），IL-4水平明显降低（P=0.001），T淋巴细胞凋亡百分比明显升高（P=0.017）;HSP患儿IL-2水平与凋亡百分比呈正相关（r=0.716，P0.01），IL-4水平与CD ₃CD ₂₅ 抗原表达量呈正相关（r=0.785，P0.01）。结论 HSP患儿存在PBMC活化亢进，IL-2水平明显降低而IL-4水平明显升高，且凋亡延迟;IL-2水平越低T淋巴细胞凋亡越延迟;IL-4水平越高T淋巴细胞活化越多;地塞米松可能是通过调节Th ₁ 、Th ₂ 细胞网络的平衡，抑制T淋巴细胞的活化及促进T淋巴细胞的凋亡而发挥作用。

关键词 过敏性紫癜 活化 分泌 凋亡地塞米松

To systematically explore the activation，secretion，apoptosis on culturedperipheral

blood mononuclear cells（PBMC） in children with Henoch-Schonlein purpura（HSP）

Ji Ping，Lu Siguang，Chen Jun.

The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Jiangsu222500.

【Abstract】 Objective To systematically explore the immune function and thetreatment effects of dexametha_ˉsone（Dex）in children with Henoch-Schonlein purpura（HSP）.Methods The changes of activation，secretion，apoptosis on culturedperipheral blood mononuclear cells（PBMC）in children with HSP and healthy children，and contrast with the effects of dexamethasone（Dex）respectively were observed.The expression of cultured PBMC activa_ˉtion markers such as CD ₃ ，CD ₂₅ on cell surface were assayed with flow cytometry（FACS）and apoptosis cell count of PBMC were also measured by FACS.Cytokines such as IL-2，IL-4in the supernatantof cultured PBMC were de_ˉtected by ELISA.Results The percentage of CD ₃⁺ CD ₂₅⁺ cells was significantly higher（P=0.011），the level of IL-4was significantlyhigher（P=0.00023）and IL-2significantly lower（P=0.0056），while the rate of apoptosis was significantly lower（P=0.03）in the children with HSP than that of the healthy children.After affected by Dex in the HSP patient，the percentage of CD ⁺₃ CD ₂₅ ⁺ （p=0.024）cells decreased significantly（P=0.028），the level of IL-4decreased significantly（P=0.001），the rate of lymphocytes apoptosis increased significantly（P=0.017）;the level of IL-2decreased，but the difference was not significant（P=0.569）.The elevated level of IL-4positively correlated with the increased expression of CD ₃ CD ₂₅ in the HSP patients（r=0.785，P0.01）.The decreased level of IL-2positively correlated with the rate of T lymphocytes apoptosis in the HSP patients（r=0.716，P0.01）.Conclusion There exist multiple immune regulatory disturbance in HSP patients，for example，the function of Th ₁ was decreased while the function of Th ₂ was increased，lymphocytes apoptosis wasdelay and activation of PBMC was significantly in_ˉcreased.The treatment of Dexhas obvious immune regulatory effect and is an effective therapy，such as inhibitingT-cell’s activation，raising the rate of T-cell’s apoptosis and inhibiting the function of Th ₂ .

Key words henoch-Schonlein purpura activation secretion apoptosis dexamethasone

过敏性紫癜（HSP）可能与IgA介导的免疫反应有关，是由于抗原抗体免疫复合物沉积、激活补体，导致毛细血管小血管及其周围产生炎症，血管壁通透性增高，从而产生紫癜各种局部或全身症状，所以该病是一种免疫复合物介导的系统性小血管炎。HSP患儿存在免疫功能紊乱，主要表现为细胞免疫功能低下，炎症介质分泌增多，多克隆B细胞活化及免疫球蛋白的分泌增加。虽然国内已有许多学者对HSP患儿的免疫功能做了相关报道，但系统研究仍较少，本文就HSP患儿外周血单个核细胞的免疫功能及地塞米松作用做了系统的研究，为该病的治疗判断预后寻求新的途径提供依据。具体如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 HSP组患儿16例（均来自于徐州医学院附属医院儿科），其中男9例，女7例，平均年龄为7.5岁，均符合《实用儿科学》（第6版）诊断标准，且近一个月未用过地塞米松等免疫抑制剂（临床一般资料见表1）。另外选择20例健康同龄儿童（采血前健康，无服用糖皮质激素等免疫抑制剂史）作为正常对照组。并且分别在每组内分设两组，一组为地塞米松组，另一组为空白对照组。

1.2 实验方法及步骤

1.2.1 密度梯度离心法制备单个核细胞，用RPMI-1640完全培养液调备细胞悬液;0.4%台盼兰排除计数，活细胞数95%。

1.2.2 淋巴细胞凋亡的检测 （1）细胞培养:用RPMI-1640完全培养液调细胞数达1×10 ⁶/ml，分设2组:地塞米松组:地塞米松100μl+1ml细胞悬液;空白对照组:1ml细胞悬液+RPMI-1640完全培养液100μl。使每组地塞米松终浓度为1×10 ^-5 mol/L，加24孔培养板上置37℃、5%CO ₂ 加湿孵箱中培养72h。（2）将以上2组培养的细胞悬液1500r/min离心5min收取细胞，PBS液2ml洗涤2次后用75%乙醇固定，置-20℃冰箱冻存12h以上。（3）将乙醇固定的细胞悬液1500r/min离心5min收取细胞，再用PBS液洗涤2次，然后用1ml PI工作液将细胞重悬，4℃避光孵育30min。（4）流式细胞仪分析:凋亡细胞在流式细胞仪（美国Calibur公司）检测DNA直方图上呈现特征性的二倍体峰，按500～600cells/s计数1×10 ⁴ 个细胞。根据二倍体及亚二倍体峰，用Modfit LT-Unititle分析软件分析细胞凋亡率（APO）。

1.2.3 淋巴细胞CD ₃ CD ₂₅ 抗原的检测 （1）取RPMI-1640完全培养液调细胞数达1×10 ⁶ /ml，分2组，分组方法同上。置24孔培养板中于37℃、5%CO ₂ 加湿孵箱中培养72h。 （2）每组中分别加入CD ₃ 单抗（鼠抗人CD ₃ -IgG/FITC，购自IQ公司）15μl、CD ₂₅ 单抗（鼠抗人CD ₂₅ -IgG/PE，购自IQ公司）15μl，37℃孵育30min;收取细胞后用PBS液1500r/min离心5min，洗涤2次;加PBS液1ml重悬细胞送流式细胞仪检测CD ₃ CD ₂₅ 表达量。

1.2.4 淋巴细胞分泌的IL-2、IL-4水平的检测 （1）用RPMI-1640完全培养液调细胞数达1×10 ⁶ /ml，分组同上，加入24孔培养板上，置37℃、5%CO ₂ 加湿孵箱中培养72h。（2）收取培养的细胞悬液于EP管中，以8000r/min离心5min，收集上清液置-70℃冰箱中冻存待检;用EILSA法检测IL-2、IL-4含量。（按华美公司ELISA试剂盒上的操作说明书进行操作）。

1.2.5 统计学处理 所有数据均以X±s表示，用Excel统计软件对结果进行t检验及线性回归分析，P0.05为统计学差异有显著性。

2 实验结果

见表1。

2.1 CD ₃ CD ₂₅ 表达量 HSP患儿PBMC中CD ₃ CD ₂₅ 表达量较健康儿童明显升高（P=0.011），而HSP患儿地塞米松组与空白对照组比较CD 3 CD 25 表达量明显降低（P=0.024）。见图1、图2。

2.2 IL-2、IL-4水平 HSP患儿IL-2水平较健康儿童明显下降（P=0.0056），HSP患儿地塞米松组IL-2水平较空白对照组稍有下降，但差异无显著性（P=0.56）;HSP患儿IL-4水平较健康儿童明显升高（P=0.00023），HSP患儿地塞米松组IL-4水平较空白对照组明显下